分子生物学技术在肿瘤早期诊断中的应用

　　1956年Ingram发现分子水平的微小差别就可导致镰形细胞病（sickle cell disease）之后，人们逐渐认识到从分子水平探究疾病和寻找对策的重要性。1960年发现的费城染色体（phl染色体）在90%得慢性粒细胞白血病中都可以检测到，成为第一个诊断肿瘤的基因标志。80年代以来，分子生物学研究表明，一些基因与肿瘤的发生、发展及生物学行为有着极其密切的关系。随着人类基因组计划的完成和基因组计划后时代的到来，越来越多的肿瘤相关基因被鉴定和克隆出来，肿瘤的临床诊断和治疗工作也面临着向整体水平、细胞水平和分子水平相结合的转变。

　　一、瘤基因诊断的临床意义

　　目前临床工作中肿瘤的手术前诊断基本依据疾病表现（症状及体征）、各种辅助检查（CT、 MRI、B超等）及实验室检查（血清学及生化学检查等）；而术中和术后的确定诊断则主要依据病理冰冻切片和HE切片。而以上这些工作都是以肿瘤的基因表型为根据，因此敏感性不强，特异性不高，出现时间较晚，常不能早期明确诊断甚至延误病情。基因诊断是指应用聚合酶链反应（PCR）、基因探针等分子生物学、分子遗传学技术，检测人的特定基因是否有异常，因此具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、取材不受组织及时间限制、可用于早期诊断的诸多优点。例如，在白血病临床治疗缓解期白血病细胞数目仍可达到1011，应用核酸杂交技术失检率约为0.05~0.15%，而应用PCR技术则可使失检率降为10-6，大大提高了白血病细胞检出的灵敏度。

　　二、瘤基因诊断的研究内容

　　１．肿瘤相关基因的发现、鉴定及确立：基因是负载着特定遗传基因的DNA分子片段，在一定条件下能够表达这种遗传信息，调控细胞的生长和分裂。无论是各种致癌因素引起的体细胞基因突变或是正常基因丢失以及正常细胞分化过程中基因调控异常还是遗传基因导致生殖细胞突变，其最终结果均可使基因表达发生紊乱，以至进行异常表达，出现异常表型，影响细胞形态和生物活性，导致癌变发生。目前研究的结果认为，肿瘤的产生往往是由于数个不同肿瘤相关基因的异常不断积累所致。随研究的不断深入发现不同肿瘤发生异常的基因不同，某些类别的肿瘤有特异的基因变异。目前发现与肿瘤密切相关的主要有四类基因：癌基因（rasHKN ,src,myc,erbB2,met,akt2,mdm2等）；抑癌基因（Rb,p53,APC,mts/p16等）；DNA修复基因（如Hmlhi）；遗传易感基因，如3p14-21.3,17p13(p53)。

　　２．瘤早期诊断及病程进展、转移和复发中的监测和癌前病变的辅助诊断中的作用：由于肿瘤发生过程中存在的去分化和返祖现象，在病理工作中偶尔会遇到一些肿瘤难以判断组织来源，依据肿瘤相关基因的变异情况可间接反映其组织来源，因而可通过检测某些基因来鉴别其组织来源和原发部位。鉴于不同肿瘤发生异常的基因不同，基因诊断还可对肿瘤类型进行基因水平的鉴别诊断。例如通过N-my和C-myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值，因神经母细胞瘤N-myc明显扩增和过表达，而C-myc的扩增和过表达则主要存在于神经上皮瘤。C-fmc基因的激活在粒细胞性白血病表现为阳性，而在淋巴细胞性白血病无论是T细胞还是B细胞都为阴性，因而可作为白血病分类的鉴别诊断指标；而在T淋巴细胞白血病T细胞受体基因重排则是其特异的标志，借此可与B淋巴细胞性白血病区分开来。

　　３．解答临床医学提出的科学问题，对肿瘤生物学行为进行判断（包括恶性程度、对放疗、化疗敏感性及耐药性等），指导临床进行个体化治疗：随着基础研究与临床研究不断配合深化，发现肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的生物学行为密切相关。基因诊断不仅有助于发现处于早期的癌变细胞，而且还可对肿瘤类型进行基因水平的鉴别诊断，即可区别不同个体同一种肿瘤生物学特性的差异，进而指导临床根据患者个体的特性制定综合治疗方案。例如在临床用药方面，有学者提出了应采取因人施治的用药新观念。在临床用药中常可见到这样的现象：换同样疾病的患者对同一种药物产生的反应千差万别，如在某些患者身上产生应有的疗效，有的患者则基本没有什么好转的迹象，有的患者则发生不同程度的药物耐受。目前有学者提出解决这一问题的前景——用药基因学（pharmacogenomics）的方法因人施治。药物基因学主要研究人体对药物反应过程中基因的作用。影响药物体内效应的一个重要因素是肝脏的代谢酶系统，而造成酶功能差异的则是决定其结构和功能DNA序列。一旦确定了病人之间肝代谢酶的基因学差异，就有助于临床新药的开发和临床指导用药，因人施治。

　　４．遗传缺陷的鉴定：遗传与肿瘤密切相关，有某些遗传缺陷或疾病的个体会表现出易患某些肿瘤的倾向，这就是一种对肿瘤的遗传易感性（genetic susceptibility）。肿瘤分子遗传学研究发现，部分肿瘤的发生具有遗传学基础，故肿瘤遗传相关地易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛选具有实用价值。鉴定遗传缺陷，研究肿瘤的易感性，将易感人体从人群中筛选出来，对他们进行肿瘤防治以降低肿瘤的发生率和死亡率，这是肿瘤预防、诊断和治疗方面的重要步骤。已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤检测有Rb（视网膜母细胞瘤）、WT1(肾母细胞瘤)，P53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、VHL(VonHippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和cowden综合征)等。除了检测高危病人群的肿瘤易感性检测，如检测Ret基因突变用于诊断Ⅱ型多发型内分泌瘤，BRCA连锁分析用于家族型乳腺癌和卵巢癌的诊断，通过分析谷光苷肽S转移酶基因型及诊断个体暴露与致癌时的致癌危险性等。

　　５．配合生物治疗和基因治疗：只有已知患者疾病相关基因的改变情况，才能“对症”进行生物治疗和基因治疗。因此，基因诊断是生物治疗和基因治疗的前提和基础；生物治疗和基因治疗离不开基因诊断的密切配合。如果能够对基因变异定位明确，那么基因治疗手段就有可能成为肿瘤根治的理想途径。