分子生物学基本技术在肿瘤研究中的应用

　　DNA重组技术（或基因工程）是20世纪生物学的伟大成就，并已渗透到生命科学包括医学 各个领域，为肿瘤的实验研究和临床诊断及治疗提供了崭新的技术和有用的工具。本附录扼要介绍在分子肿瘤学领域中常用的分子生物学基本技术及其在肿瘤研究中的应用，着重介绍它们的原理和应用。至于具体的技术方法和操作步骤可参阅《分子克隆实验指南》（第二版，科学出版社，1992年）等实验指导。

　　一、常用的分子生物学基本技术

　　核酸分子杂交技术

　　由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。

　　固相杂交

　　固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。

　　斑步杂交（dot hybridization）

　　是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。

　　印迹杂交（blotting hybridization）

　　Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。

　　Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。

　　差异杂交（differential hybridization）

　　是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。

　　cDNA微点隈杂交（cDNA microarray hybridization）

　　是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。

　　寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization）

　　是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。

　　液相杂交（solution hbridization）

　　指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。

　　递减杂交（subtractive hybridizatio）

　　是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA（或逆转录成的cDNA）,在一定的条件下以过量的驱动mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交，通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分，保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDNA文库，可获得特异表达的目的基因cDNA全长序列。

　　核酸原位杂交

　　用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布，与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。

　　该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学生物学的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量，方法更为完善。

　　DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）

　　在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。

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